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唉~~
換實驗了
原本的實驗做不出來
卡在....gel elution後 DNA回收率太太太太太太太低
所以....沒輒了!!
現在換建立cDNA library
做到雙股 恩 OK...簡單!
分離小片段的DNA...OK 回收率也不錯!!(果然具300元的價值)
取250ng DNA去接adaptor.....按protocol加藥 easy拉!(雖然我也不知道它接的效果怎樣)
再將adaptor 磷酸化....一樣按protocol
然而
重點來了
磷酸化完後的DNA
要萃取！要萃取！要萃取！
囧了.....
萃取的回收率....回收率....回收率呀呀呀呀
如何才能提高呢?????
按kit的protocol
首先經由phenol:cholroform/IAA萃取
再通column去掉adaptor，最後用酒精沉澱
total放下去反應的DNA也不過才250ng
這樣要萃取什麼鬼啦
用 Geneaid的clean up protocol來萃
呿!!又不是找死...回收率低的跟鬼一樣(爛kit！騙錢！)
所以只好按我自己的方式來萃了
以下是我改善的方法
先將磷酸化完後的DNA通column去掉 adaptor
之後再以酒精沉澱DNA即可
會這麼做是有我的考量的
萃取DNA主要要去掉buffer跟蛋白質
所以ㄧ般而言應該要先經由phenol:choloform/IAA萃取
將protein denature後再以酒精沉澱
可是....在phenol萃取步驟中....無法將水層完全吸完
所以想必此步驟也會lost 掉不少的DNA
按原理而言
酒精沉澱的步驟，除了可以將DNA沉澱下來
ㄧ方面它可以去掉phenol, choloform等有機質
另外酒精也可以denature protein (當然也有些水溶性蛋白或許不受影響)
挖~~讓蛋白質變性! 變性! 變性!
我就取這個特點，因而省去phenol萃取denature protein的步驟
感覺貌似似乎有點道理後?
所以....今天就這樣做了
雖然萃取後的DNA依然不見pellet......(廢話!原本DNA就不多了)
不過嚇不倒我的
當初用NEB製probe的Kit
最後沉澱DNA的步驟還不是沒有pellet
可是測試過後它的確有東西
所以.....今天萃的那管一定有DNA一定有DNA一定有DNA拉(自我說服中....)
唉~~如果明天跑膠跑不出東西的話
我就囧了....等於浪費了將近2000元....
話說我做這個論文，好像已經用掉好幾萬了.....
雖然不是花自己的錢，不過還是覺得不好意思...
宋老師，我對不起妳...
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如果問我 修了論文讓我學習到什麼?
我會回答....
學習到解決問題的能力! (張婉亘握手!!)
我好像做過很多東西
Try過很多方法
比價過很多家公司
謎思:
我真的是在做大學部論文嗎???
怎麼感覺很像在過研究生的生活.....
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~期待成為萃取DNA的達人~
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